研究簡(jiǎn)介:木質(zhì)纖維素(cellulose)是由葡萄糖組成的大分子多糖。不溶于水及一般有機溶劑。甲殼動(dòng)物蛀木水虱危害木船和碼頭木質(zhì)設施,俗稱(chēng)“吃木蟲(chóng)”。研究發(fā)現蛀木水虱有一定的益處,其體內含有一種特殊的酶,有助于將木頭分解為生物能源。蛀木水虱體內并沒(méi)有幫助消化木質(zhì)的微生物,研究人員發(fā)現完全靠自己將木質(zhì)纖維素分解為糖分。本論文主要就甲殼動(dòng)物蛀木水虱中存在的血液蛋白酶如如何實(shí)現對木質(zhì)纖維素的消化,了解其體內存在的蛋白酶對纖維素水解的機理,從而將有助于科學(xué)家們設計出更強大的酶用于工業(yè)生產(chǎn)。


Unisense微電極系統的應用


unisense公司的pH電極和氧氣微電極應用于動(dòng)物腸道內的pH測試及氧濃度的測試。實(shí)驗過(guò)程中,蛀木水虱用針刺頭和針固定在瓊脂糖板上(上覆有海水)。在鑷子的幫助下,切除蛀木水虱胸椎節段,露出了蛀木水虱后腸,使用尖端直徑為25μm的pH值微電極和尖端直徑為10μm氧氣微電極(Unisense、丹麥)對蛀木水虱的上腸腔到后腸腔內的氧氣和pH進(jìn)行了測試。傳感器尖端被引入信號穩定后記錄下腸組織內部不同區域的pH值和氧濃度值。


實(shí)驗結果


木質(zhì)(木質(zhì)纖維素)植物是一種豐富的可再生原料,富含多糖與木質(zhì)素結合成不溶性纖維的復合材料。海洋甲殼類(lèi)動(dòng)物林棲動(dòng)物屬的伐木工是少數能以這種食物為生而不依賴(lài)腸道寄生菌群的動(dòng)物之一。糞便顆粒分析說(shuō)明蛀木水虱以含己糖的多糖(主要是纖維素)為目標與消化系統中纖維素酶的豐富程度相對應,但是木蘭和木質(zhì)素基本未被消耗。研究證明了蛀木水虱的呼吸蛋白,血藍蛋白,在木材被消化的后腸中含量豐富,與木材一起孵育血藍蛋白通過(guò)纖維素酶顯著(zhù)提高其消化率,并對木質(zhì)素進(jìn)行了修飾。我們提示血藍蛋白的這種活性對蛀木水虱的攝食能力是有幫助的沒(méi)有腸道共生體的木材。這些發(fā)現可能會(huì )帶來(lái)創(chuàng )新木質(zhì)纖維素生物煉制。

圖1、柳樹(shù)木主要生物高分子組成成分的消化前后。圖a表示的是蛀木水虱的糞便顆粒掃描電鏡(尺寸-50μm)。b從木材(柳樹(shù),N=10)和糞球(糞便78%,為消化過(guò)程中的質(zhì)量損失,N=8)組分包括乙酰溴化的可溶性木質(zhì)素(藍色)、TFA-可溶性半纖維素(紅色)和硫酸酸性的可溶性纖維素(橙色)。圖c表示的是木材纖維素組分消化前(柳樹(shù),N=11;(暗橙色)的單糖組成(絕對含量)和消化后(糞便78%,消化過(guò)程中歸一化的質(zhì)量損失,N=8;淡橙色)在使用三氟乙酸(TFA)水解后,連續H2SO4水解進(jìn)行的分析。d木材半纖維素組分單糖組成(絕對含量)(柳樹(shù)N=11;消化后(糞便78%,歸一化為消化過(guò)程質(zhì)量損失,N=10;淡紅色)TFA水解分析。圓圈表示樣本值。Fuc,海藻糖,Ara,阿拉伯糖;Rha,鼠李糖;半乳糖;Glu、葡萄糖;Xyl,木糖;,甘露糖;GalA,半乳糖醛酸。

圖2、蛀木水虱的消化系統組成示意圖。圖a表示的是蛀木水虱側面示意圖(通常2-3mm長(cháng)),圖中顯示兩個(gè)雙葉肝胰酶(Hp)中的一個(gè),連接了管狀腸的前部;流形(M)和過(guò)濾系后統(FS)位置如圖所示,后腸部分食物質(zhì)量為暗色,腸道不同測量位置點(diǎn)的pH值。B腸道的幾丁質(zhì)角質(zhì)層內襯的掃描電子顯微照片(比例尺寸、5μm)。圖C表示的是脾肝胰腺細胞微絨毛(Mv)的肝胰腺內腔的透射電子顯微照片(比例尺寸,2μm)。圖D表示的是應用微電極測試蛀木水虱后腸(腸)區域,蛀木水虱身體區域及進(jìn)入周?chē)尤氲暮K械难鯘舛?尺寸的規模0.5 mm)。

圖3、蛀木水虱消化過(guò)程蛋白質(zhì)的轉錄和天然血青素提取物。圖a表示的是蛀木水虱后腸液中糖基水解酶(GH)家族相對豐度的測定。圖b表示的是蛀木水虱的后腸血青蛋白相對豐度通過(guò)血青蛋白相對摩爾百分比的比較,分為組織(包括固體含量)和液體部分。圖c表示的是從蛀木水虱克隆的GH家族5、7、9各2個(gè)成員的相對基因表達差異。圖d表示的是蛀木水虱內的4個(gè)血青蛋白基因的相對表達差異。圖e表示的是蛀木水虱體內的血藍蛋白的凝膠(SDS-PAGE)電泳圖。圖f表示的是經(jīng)陰性醋酸鈾酰染色的天然蛀木水虱中血藍蛋白的提取物的TEM圖像顯示。

圖4、焦糖醇和分離木質(zhì)素的血青苷活性。圖a表示的是變色菌屬蟲(chóng)漆酶與活化的在以NaPO4、pH為6.8,含有1nm的焦棓酸培養孵化的血藍蛋白的紫外-可見(jiàn)光譜圖。圖b表示的是堿木質(zhì)素(3%)在海水(SW,黑色)或含血藍蛋白(Hc,紅色)經(jīng)1h孵育后的13C固相核磁共振13C譜圖。

圖5、室溫下短血藍蛋白預處理后楊柳樹(shù)木的消化率。其中楊柳消化率測定采用的是生物量預處理糖化反應中每單位生物量釋放纖維二糖(nmol)的量(mg)。預處理包括在海上中對血藍蛋白的預處理(Hc暗紅色)、單獨的海水處理(SE淡藍色)、沒(méi)有處理(藍色)和使用了50mM DTPA(螯合劑)處理(淡紅色)。圖b表示的是應用CBH I進(jìn)行糖化后的紅褐肉座菌(HjCBHI)。水解產(chǎn)物是根據分析HPAEC中纖維低聚物標準。所獲得的數值是對預處理后沒(méi)有CBH的反應進(jìn)行歸一化,來(lái)反映血青苷的制備過(guò)程中剩余的纖維素酶活性。


結論與展望


英國約克大學(xué)、樸次茅斯大學(xué)以及美國國家可再生能源實(shí)驗室的科學(xué)家使用先進(jìn)的生物化學(xué)分析方法和微電極技術(shù),找出了蛀木水虱體內能分解木頭的酶并揭示了其結構和功能。在研究過(guò)程中,研究人員為了充分了解蛀木水虱體內蛋白酶分解木質(zhì)纖維素的的機理,應用unisense公司的氧氣及pH微電極成功實(shí)現了對甲殼動(dòng)物蛀木水虱體內的腸道組織內的氧氣及pH實(shí)現了原位的測試,由于該微電極具有空間精度高(尖端直徑為25um或10um)、測試相應速度快(2s),很好的幫助科研人員對活體的甲殼動(dòng)物蛀木水虱體內的相關(guān)環(huán)境(pH/氧濃度等)進(jìn)行了原位測試,從而更好的了解蛀木水虱體內存在的這種分解木質(zhì)纖維素酶的工作原理,很好的揭示了其結構和功能,成功的揭示了纖維素鏈如何被消化成葡萄糖。該研究結果將有助于科學(xué)家們設計出更強大的酶用于工業(yè)生產(chǎn),這說(shuō)明微電極在研究關(guān)于地將廢紙、舊木材和稻草等廢物變成液體生物燃料領(lǐng)域存在很好的應用前景。