數據分析


GRAPHPAD PRISM 5.0（GRAPHPAD Software Inc.，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國）用于單因素或雙因素方差分析（Tukey或Bonferoni事后檢驗）和學(xué)生t檢驗，以比較均值。在水下凈光合作用與外部CO2或O2濃度的實(shí)驗中，也使用GRAPHPAD PRISM將數據集擬合到預測模型（高斯和Michaelis-Menten）。


結果


黎明和黃昏時(shí)葉片有機酸和可滴定組織酸度


黎明和黃昏蘋(píng)果酸或可滴定組織酸度的比較是CAM活性的診斷測試（Lu–ttge，2004），因此，我們在澳大利亞鳶尾的葉綠葉部分（即綠色葉尖）測量了這些參數。與黃昏相比，黎明時(shí)蘋(píng)果酸濃度高9.7倍，表明CAM活性（圖2）。檸檬酸鹽濃度在黎明時(shí)也較高，盡管晝夜振幅低得多（1.9倍），黎明時(shí)的絕對濃度僅為蘋(píng)果酸的24%（圖2）。葉勻漿的可滴定酸度從黎明時(shí)的250變化到黃昏時(shí)的4 lmol H+當量g）1 FW（圖3），支持了存在大量CAM活性的結論。此外，當滴定開(kāi)始于或低于蘋(píng)果酸的第一個(gè)pKa時(shí)，D蘋(píng)果酸與D酸度的比率為0.46，接近預期值0.50。因此，蘋(píng)果酸是用于儲存夜間固定二氧化碳的主要有機酸（圖2）。


圖2沉水水韭葉片中的有機酸（蘋(píng)果酸和檸檬酸）。在黑暗前16小時(shí)后的黎明（開(kāi)放柱）或在光線(xiàn)下8小時(shí)后的黃昏（封閉柱）對組織進(jìn)行采樣。條形代表平均值±SE（n=4）***蘋(píng)果酸和檸檬酸的黎明和黃昏值顯著(zhù)不同（P<0.001；Student t檢驗）。


不同蘋(píng)果酸狀態(tài)葉片水下凈光合作用對溶解CO2的響應


已假設CAM的存在可以在沉水植物中外部CO2較低時(shí)維持凈光合作用（Madsen，1987）。我們通過(guò)比較蘋(píng)果酸高（黎明）或低（黃昏）葉片的CO2響應曲線(xiàn)來(lái)測試CAM活性的潛在益處。水下凈光合作用的CO2飽和速率在高蘋(píng)果酸和低蘋(píng)果酸葉片之間沒(méi)有差異，在這兩種情況下均為2.3 lmol O2 m）2 s）1（圖4）。高蘋(píng)果酸和低蘋(píng)果酸葉片的響應曲線(xiàn)在300 mmol CO2 m）3及以下顯著(zhù)偏離，低蘋(píng)果酸葉片的水下凈光合作用較低。蘋(píng)果酸含量高的葉片水下凈光合速率高，這可能與蘋(píng)果酸脫羧更多導致的CO2更高可用性有關(guān)。


圖4水下凈光合作用與20℃下140 mmol O2 m）3培養的浸沒(méi)水韭葉片中外部CO2濃度的關(guān)系。在黑暗前16小時(shí)的黎明（高蘋(píng)果酸，開(kāi)放圓圈）或在光線(xiàn)下8小時(shí)后的黃昏（低蘋(píng)果酸，封閉圓圈）對組織進(jìn)行采樣。每個(gè)數據點(diǎn)代表平均值±SE（n=5）。數據擬合到具有y軸常數的Michaelis-Menten模型。


表觀(guān)光呼吸的評估；對比蘋(píng)果酸狀態(tài)下葉片水下凈光合對O2的響應


沉水植物的光呼吸可能很高，尤其是當CO2耗盡且O2增加遠高于空氣平衡時(shí)，因此Rubisco的CO2:O2比率較低。由于CAM可以抑制陸生植物的光呼吸（Lu–ttge，2002），我們評估了蘋(píng)果酸含量高或低的南花薊馬葉片的光呼吸是否不同。通過(guò)研究增加O2對水下凈光合作用速率的影響來(lái)評估表觀(guān)光呼吸（圖5）。


圖5.水下凈光合作用與水下水韭葉片中外部O2濃度（孵化期間的平均值）的關(guān)系，該葉片取自水下水韭，并在20℃下用30 mmol CO2 m）3孵化。在前一個(gè)黑暗16小時(shí)后的黎明（高蘋(píng)果酸，開(kāi)放圓圈）或在光照8小時(shí)后的黃昏（低蘋(píng)果酸，封閉圓圈）對組織進(jìn)行采樣。每個(gè)數據點(diǎn)代表平均值±SE（n=5），數據擬合到高斯模型。20℃時(shí)，O2在水中的空氣平衡為284 mmol m）3。


蘋(píng)果酸含量低的葉片的表觀(guān)光呼吸顯著(zhù)高于蘋(píng)果酸含量高的葉片；當溶解氧濃度為空氣平衡濃度的2.2倍（即625 mmol m）3時(shí)，低蘋(píng)果酸組織的凈光合作用為負值，而高蘋(píng)果酸組織的凈光合作用雖然降低，但仍為正值（圖5）。當溶解的O2處于空氣平衡時(shí)，低蘋(píng)果酸葉片的光呼吸甚至顯著(zhù)；空氣平衡時(shí)的凈光合作用僅為這些葉片最大速率的31%——凈光合作用速率在140 mmol O2 m）3時(shí)最高，約為空氣平衡時(shí)溶解O2濃度的一半。在高蘋(píng)果酸葉片中，雖然凈光合作用在溶解氧濃度為160 mmol m）3時(shí)最大，但當O2處于空氣平衡時(shí)，凈光合作用僅降低到最大速率的67%。此外，在這種含30 mmol CO2（m）3的溶液中，高蘋(píng)果酸葉片的最大水下凈光合作用是低蘋(píng)果酸葉片的1.5倍。在284 mmol O2 m）3下，凈O2產(chǎn)生量（即表觀(guān)光呼吸）的減少超過(guò)Rd（Rd=0.14±0.02 lmol O2 m）2 s）1的5.7倍；n=4），因此推斷的光呼吸明顯超過(guò)Rd。除了在高O2下凈光合作用下降外，在最低測試O2濃度（25 mmol m）3下也下降，可能是由于組織缺氧?？傊?，隨著(zhù)CO2:O2的減少，具有高CAM的葉片（即高蘋(píng)果酸葉片）表現出較低的表觀(guān)光呼吸，因此CAM脫羧作用較低。


圖6在低（c.0.5空氣平衡；140 mmol m）3）或高（2.2倍空氣平衡；625 mmol m）3）外部O2濃度下測得的從水韭（a）或在空氣中形成的葉子（b）中采集的葉子的水下凈光合作用。在20°C下對黎明時(shí)采集的葉片（高蘋(píng)果酸，開(kāi)放條）在黑暗中16小時(shí)后進(jìn)行測量，或在黃昏時(shí)采集的葉片（低蘋(píng)果酸，封閉條）在光線(xiàn)下8小時(shí)后進(jìn)行測量。條形代表平均值±SE（n=4），字母表示組織類(lèi)型和治療之間的顯著(zhù)差異（P<0.05）。


空氣中形成的葉片的水下凈光合作用


當幾種水韭物種出現在水面上時(shí)，在空氣中形成的葉子會(huì )形成氣孔，它們在C3光合作用中直接利用大氣中的CO2，而CAM活性則會(huì )喪失，這可以通過(guò)低D酸度來(lái)證明（Keeley等人，1983a，b）。南方水韭也能夠與暴露在空氣中的枝條一起生長(cháng)，但在空氣中形成的葉片仍然缺乏氣孔，盡管葉片周轉量約為1葉wk）1（Keeley，1983b）。我們評估了在空氣中形成的葉片的氣孔、鈣調素活性和水下凈光合作用的存在情況（植物脫浸水6周），并與在水下形成的葉片（持續浸水）進(jìn)行了比較。在浸水基質(zhì)中，葉片在空氣中放置6周的植物，沒(méi)有氣孔?？諝庵行纬傻娜~片中蘋(píng)果酸濃度在黎明時(shí)也保持較高（103±21 lmol g）1 FW；平均值±SE，n=3；參143±15 lmol g）1 FW在沉水植物葉片中；圖2）。當測試在空氣中形成的葉片對水下凈光合作用的影響時(shí)（圖6），發(fā)現黎明時(shí)采集的樣本（蘋(píng)果酸含量高）比黃昏時(shí)采集的樣本（蘋(píng)果酸含量低）受影響較小，這進(jìn)一步證明了在空氣中形成的葉片中存在大量CAM活性。與水下葉片觀(guān)察到的模式類(lèi)似，在外部O2升高的情況下，低蘋(píng)果酸葉片（黃昏）的水下凈光合作用受到強烈限制；這些蘋(píng)果酸含量低的葉片表現出O2的凈消耗（高表觀(guān)光呼吸；圖6）?？傊?，在空氣中形成的葉子維持CAM活性。


討論


本研究評估了CAM對受到低CO2和高O2濃度挑戰的植物水下凈光合作用的影響，這些條件通常存在于濕地和巖石池中，可能導致高光呼吸。比較了高蘋(píng)果酸濃度和低蘋(píng)果酸濃度（即預期分別具有高脫羧率和低脫羧率）的水生物種即australis的葉子。CAM活性高的葉片保持較高的水下凈光合作用，尤其是在較低的外部CO2濃度下，并且具有較低的表觀(guān)光呼吸，尤其是當O2濃度增加時(shí)。這些發(fā)現證明了CAM光合作用對沉水植物的潛在益處，因為水下CO2和O2濃度的波動(dòng)可能很大（Van等人，1976年）。例如，日出后，水中的CO2濃度通常會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的推移而降低，O2濃度會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的推移而增加，日落后，情況會(huì )相反（Keeley&Rundel，2003）。


CAM導致的光呼吸減少可能與生長(cháng)在動(dòng)態(tài)CO2和O2濃度棲息地中的I.australis和其他水生物種有關(guān)。淺季節性游泳池的溶解氧晝夜變化劇烈，下午濃度高（西澳大利亞臨時(shí)花崗巖巖游泳池為35 kPa（數據未顯示），加利福尼亞春季游泳池為30 kPa（Keeley，1983a））。水柱的這種過(guò)飽和將顯著(zhù)限制澳大利亞鳶尾的水下光合作用，但對蘋(píng)果酸濃度高的葉片影響較?。▓D5和6）。然而，由于水中的O2濃度未達到空氣平衡濃度的2.2倍，預計CAM活性對光呼吸的原位保護將在圖5和6所示的極限范圍內，當下午晚些時(shí)候O2濃度最高時(shí)，大部分蘋(píng)果酸通常已經(jīng)脫羧基（Keeley等人，1983a）。然而，由于即使在O2的亞大氣平衡條件下，CAM也會(huì )限制光呼吸（圖5），因此預計CAM在抑制光呼吸方面的有益作用仍會(huì )在當天早些時(shí)候出現。澳大利亞I.australis中的高CAM活性可能表明，澳大利亞臨時(shí)花崗巖巖池是CCMs，尤其是CAM對維持高水下光合作用至關(guān)重要的環(huán)境。CCMs在巖石池中的重要性進(jìn)一步得到共生物種中的光合途徑的支持（克拉蘇拉natans，CAM；Eleocharis，CAM和有時(shí)C4的物種；Marsilea的物種，未知但不是CAM；Keeley，1998a，b）。


長(cháng)期以來(lái)，基于與缺乏CCM的水生物種相比，具有CCM的水生物種水下凈光合作用的CO2補償點(diǎn)較低，人們一直認為CCM會(huì )減少水生植物的光呼吸（Salvucci&Bowes，1983；Madsen，1987）。在這里，在O2濃度范圍內測量可用于脫羧的蘋(píng)果酸量不同的組織的水下凈光合作用，可以評估表觀(guān)光呼吸（圖5）。光呼吸隨著(zhù)凈O2產(chǎn)生率的下降而明顯（光呼吸相對于光合作用增加），甚至在培養基中（因此在葉片內）高O2:CO2時(shí)O2的凈消耗。與蘋(píng)果酸濃度高的葉片相比，蘋(píng)果酸濃度低的葉片的表觀(guān)光呼吸顯著(zhù)更高；例如，即使在空氣平衡的O2溶液中，低蘋(píng)果酸葉片中的光呼吸已經(jīng)相當顯著(zhù)（凈O2生成量減少到最大值的31%）。CAM是一種非常有效的CCM；例如，蘋(píng)果酸脫羧可導致沉水單花濱藜的腔隙中的CO2濃度高達30000ppm（Madsen，1987）；這種CO2濃度比大氣濃度高85倍，有望在Rubisco產(chǎn)生有利的CO2:O2比，減少光呼吸。


水韭葉片中的鈣調素活性隨季節和環(huán)境而顯著(zhù)變化。例如，與夏末相比，bolanderi水韭在春季的CAM活性要低得多（Keeley等人，1983b），與季節性池塘相比，從寡營(yíng)養湖泊采樣時(shí)，howellii水韭的組織酸度日變化較?。▓D3，Keeley等人，1983a）。將目前的結果與其他已發(fā)表的數據進(jìn)行比較也表明，澳大利亞錐蟲(chóng)中的CAM活性可以高度可變（圖3）；D蘋(píng)果酸的范圍從c.25（Keeley，1983b）到140 lmol g）1 FW（本研究），D蘋(píng)果酸的后一個(gè)值是水韭屬的第二高值。然而，對于I.australis來(lái)說(shuō)，D蘋(píng)果酸的一些變化可以通過(guò)我們對葉子的葉綠素部分進(jìn)行的組織分析來(lái)解釋?zhuān)渌芯靠赡苁褂昧苏麄€(gè)葉子，包括有時(shí)占葉子很大一部分的無(wú)色素部分（Keeley等人，1984）。即便如此，只有從加利福尼亞州馬瑟池采集的霍韋利氏錐蟲(chóng)顯示出較高的D組織酸度和D蘋(píng)果酸。


圖3水韭屬植物（水韭屬，小圓；水韭屬，大圓；水韭屬，正方形）葉片中組織可滴定酸度與D蘋(píng)果酸的變化（D）。D可滴定酸度和D蘋(píng)果酸的計算方法為黎明（am）減去黃昏（pm）?；貧w線(xiàn)基于整個(gè)數據集，斜率為0.46。數值來(lái)自Keeley（1983b）和本研究（兩個(gè)參數的平均值±SE）；僅包括通過(guò)滴定至pH 6.4確定可滴定酸度的值。該圖由Keeley（1998a）修改并重新繪制，添加了本研究的值，以強調物種內組織蘋(píng)果酸和可滴定酸度的范圍。因此，I.australis和I.howellii使用大符號突出顯示。


CAM是水生植物水下光合作用的重要CCM的結論得到了植物在水下時(shí)的誘導支持，但當葉子出現在空氣中時(shí)會(huì )受到抑制；例如，在水韭屬物種中（Keeley等人，1983a），Littorella（Robe&Griffiths，2000），Orcuttia calafornica和Orcuttia viscida（Keeley，1998b）。在本研究中，I.australis在空氣中形成的葉片中保持CAM活性（圖6），這些葉片不形成氣孔，這一反應類(lèi)似于半邊蓮，半邊蓮在空氣中也不形成氣孔（Pedersen&Sand Jensen，1992）。由于在整個(gè)生長(cháng)季節，臨時(shí)淺層花崗巖巖池可能會(huì )以不可預測的方式干涸和重新填充，因此，I.australis的自然環(huán)境可能會(huì )選擇這種更為保守的“結構性CAM策略”，當旱季開(kāi)始時(shí)，在沉積物也干化和植物干燥之前，空氣中有葉子的突現階段可能持續很短（天）。這兩種環(huán)境特征可能意味著(zhù)，在CAM和C3之間來(lái)回切換幾乎沒(méi)有益處。


綜上所述，利用棲息在臨時(shí)花崗巖露頭上的季節性水池中的一種CAM物種I.australis，本研究表明，在低外部CO2濃度下，蘋(píng)果酸脫羧含量高的葉子不僅增強了水下凈光合作用，而且明顯的光呼吸也受到CAM的抑制。在溶解氧濃度范圍內（包括低于空氣平衡的值）明顯抑制表觀(guān)光呼吸，本研究表明，具有CAM的水生物種的光呼吸受到顯著(zhù)抑制。


致謝


非常感謝Dion Nichol幫助獲得許可，對Allan和Craig Nichol在Mukinbudin的房產(chǎn)進(jìn)行花崗巖巖池調查和工作。我們還感謝CLEAR、Villum Kann Rasmussen卓越中心和丹麥科學(xué)理事會(huì )的財政支持。